FKM多光谱荧光动态显微成像系统
FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光谱荧光动态显微成像系统是目前功能最为强大全面的植物显微荧光研究仪器。它由包含可扩展部件的增强显微镜、高分辨率CCD相机、激发光源组、光谱仪、控温模块以及相应的控制单元和专用的工作站与分析软件组成。它不仅可以进行微藻、单个细胞、单个叶绿甚至基粒-基质类囊体片段进行Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭、OJIP快速荧光响应曲线、QA再氧化等各种荧光成像动力学分析；还能通过激发光源组进行进行任意荧光激发和荧光释放波段的测量，从而进行GFP、DAPI等荧光蛋白、荧光素以及藻青蛋白、藻红蛋白、藻胆素等藻类特有荧光色素的成像分析；更可以利用光谱仪对各种荧光进行光谱分析，区分各发色团（例如，PSI和PSII及各种捕光色素复合体等）并进行深入分析。
FKM多光谱荧光动态显微成像系统使荧光成像技术真正成为光合作用机理研究的探针，使科研工作者在细胞和亚细胞层次深入理解光合作用过程及该过程中发生的各种变化，为直接研究叶绿体中光合系统的工作机理提供了最为有力的工具。
功能特点
·内置现今叶绿素荧光研究的全部程序，如Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭、OJIP快速荧光响应曲线、QA再氧化等，可获得70余项参数。
·配备20倍和40倍专用生物荧光物镜，可以清晰观测到叶绿体及其发出的荧光。
·激发光源组中包括红光、蓝光、绿光、白光、紫外光和远红光等，通过红蓝绿三色光还可以调出可见光谱中的任何一种色光，能够研究植物体中任何一种色素分子或发色团。
·高灵敏度CCD镜头，时间分辨率最高达50张每秒，可快速捕捉叶绿素荧光瞬变。
·高分辨率光谱仪能够深入解析各种荧光的光谱图。
·控温系统可以保证实验样品在同等温度条件下进行测量，提高实验精度，也可以进行高温/低温胁迫研究。
应用领域
·显微结构的植物光合生理研究
·植物逆境研究
·生物和非生物胁迫的研究
·植物抗胁迫能力及易感性研究
·突变体筛选及光合机理研究
·藻类长势与产量评估
·藻类特有色素与光合作用关系
·植物——微生物交互作用研究
·植物——原生动物交互作用研究
·基因工程与分子生物学研究
测量样品
·植物活体切片
·植物表皮
·植物细胞
·绿藻、蓝藻等各种单细胞和多细胞微藻
·叶绿体提取液
·类囊体提取液
·含有叶绿体的原生动物
工作原理
FKM分析过程中，通过连接在显微镜上的激发光源组和内置在6位滤波轮中的一系列滤波器、分光镜激发植物样品中各种发色团的动态荧光。样品激发出的荧光经显微镜放大后进行荧光光谱分析和荧光动力学成像分析。SM 9000光谱仪通过光纤与显微镜连接，以进行激发荧光光谱分析。安装在显微镜顶部的高分辨率CCD相机则用于荧光动力学成像分析。全部工作过程通过工作站和控制单元按照预先设定好的程序自动进行。测量过程中，可通过温控模块调控藻类、植物细胞等实验样品的温度。蠕动泵可以实现培养藻类的连续测量。
仪器组成
1.增强显微镜
2.高分辨率CCD相机
3.激发光源组
4.SM 9000光谱仪
5.主控制单元
6.工作站及软件
7.控温模块的控制单元
8.6位滤波轮
技术参数
·测量参数
úF0，F0’，Fs，Fm，Fm’，Fp，FtDn，FtLn，Fv，NPQ_Dn，NPQ_Ln，Qp_Dn，Qp_Ln，qN，QY，QY_Ln，Rfd等五十多项参数
úOJIP快速荧光曲线：F0、F300、Fj、Fi、Fm、Vj、Vi、Fv / Fm、M0、SM、SS、N、Phi_P0、Psi_0、Phi_E0、Phi_D0、Pi_Abs、ABS / RC、TR0/ RC、ET0/ RC、DI0/ RC等
úQA再氧化曲线（选配）
ú荧光光谱图
·测量光：红光、蓝光、绿光、白光、紫外光
·光化光：红光、蓝光、绿光、白光、紫外光，光强为6000-20000μmol(photons)/m2.s（与光质和放大倍数有关）
·饱和光：红光、蓝光、绿光、白光、紫外光，光强为13000-80000μmol(photons)/m2.s（与光质和放大倍数有关）
·透射光：白光、远红光
高分辨率CCD：像素可调，最高达1392×1040像素，时间分辨率最高达每秒50张
显微镜：Axio Imager M2
·物镜：20倍和40倍专用生物荧光物镜
·6位滤波轮：叶绿素荧光、GFP/SYTOX、DAPI/CTC等
·SM9000光谱仪
ú入射狭缝：70μm×1400μm
ú光栅：平场型校正
ú光谱范围：200-980nm
ú波长绝对精确度：<0.5nm
ú再现性：<0.1nm
ú温度漂移：<0.01nm/K
·温度调控模块：温度调节范围5℃-70℃，精确度0.1℃
·蠕动泵（选配）：流速10-5600μl/min，用于藻类连续培养测量
FluorCam叶绿素荧光成像分析软件，具Live（实况测试）、Protocol（实验程序选择）、Pre–processing（成像预处理）、Result（成像分析结果）等菜单
Protocol实验程序可自由编辑，用户也可利用Protocol菜单中的向导程序模版自由创建新的实验程序
成像预处理可以自动选区或手动选择不同形状、不同数量、不同位置的区域（Region of interest，ROI），成像分析结果包括高时间解析度荧光动态图、直方图、不同参数成像图、不同ROI的荧光参数列表等
数据分析具备“信号计算再平均”模式（算数平均值）和“信号平均再计算模式”，在高信噪比的情况下选用“信号计算再平均”模式，在低信噪比的情况下选择“信号平均再计算”模式以过滤掉噪音带来的误差
叶绿素荧光与光谱分析结果
典型应用：
1. CLAIRE M. M. GACHON etc. Single-cell chlorophyll fluorescence kinetic microscopy of Pylaiella littoralis (Phaeophyceae) infected by Chytridium polysiphoniae (Chytridiomycota). Eur. J. Phycol., (2006), 41(4): 395–403
2. Hendrik Kupper etc. Reversible coupling of individual phycobiliprotein isoforms during state transitions in the cyanobacterium Trichodesmium analysed by single-cell fluorescence kinetic measurements. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, Volume 1787, Issue 3, March 2009, Pages 155-167
Fig. 1. 吸收光谱与荧光发射光谱：异构藻青蛋白（APC）；藻青蛋白（PC）；藻红蛋白（PE1、PE2、PE3）；藻尿后胆色素（PUB’s）
Fig.2.各种色素蛋白对F0的贡献、光谱及其随时间的变化：异构藻青蛋白（APC）；藻青蛋白（PC）；藻红蛋白（PE1、PE2、PE3）；藻尿后胆色素（PUB’s）
参考文献：
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12. Ferimazova et al. (2002): Photochem. Photobiol. 76:501-508.
13. Berman-Frank I. et al. (2001): Science 294: 1534-1537.
14. KuepperH. et al. (2000): Photosynthetica 38: 553/570.
注：该仪器未取得中华人民共和国医疗器械注册证，不可用于临床诊断或治疗等相关用途
