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【仪器仪表网 行业应用】本文在分析规模上评估了三种不同 SFC 色谱柱（PFP、diol-HILIC 和 2-乙基吡啶）对四肽 (LYLV)、八肽 (DRVYIHPF) 和九肽 (LYLVCCERG) 的 SFC 纯化。使用LC-MS分析检测和监测了三种肽的纯度。2-乙基吡啶固定相对这些肽被证明是最佳的，因为它显示出良好的峰形和分辨率。使用这种固定相，SFC 纯化方法对所有三种肽都具有重现性和精确性，观察到的低相对标准偏差范围在 0–0.02% 之间。回收率范围在 80% 至 102% 之间。
材料与方法
2.1. 化学品与试剂
甲醇、乙腈、TFA 和甲酸购自（德国默克公司）。超纯水来自 Millipore Milli-Q Gradient（美国 Millipore 公司）水纯化系统。除非另有说明，所有其他溶剂和试剂均购自默克公司（德国）。粗肽（表1）购自 AnaSpec, Incorporated（美国）。
2.2. SFC 仪器
SFC 系统（Prep SFC 30，步琦公司）由进样环、柱温箱（保持在40°C温度）、背压调节器 (BPR)（设定在 150 bar）、一个泵头保持在 5°C 的 CO₂ 泵（美国 Polyscience 公司数字冷却器）、一个用于改性剂的高压泵和一个紫外 (UV) 波长检测器（设定在 220 纳米 (nm)）组成。对四肽 (1 mg/mL)、八肽 (2 mg/mL) 和九肽 (1.5 mg/mL) 进行 50 μL 进样。本研究中使用的流动相是工业级 CO₂（南非Afrox公司）和含有 0.2% (v/v) TFA 和 5% (v/v) 水（德国默克公司）的甲醇。使用 5-60% 的梯度，其中甲醇改性剂最初保持 1 分钟，在 6 分钟内升至60%，并再保持 5 分钟。总运行时间约为 13 分钟。对于2-乙基吡啶（10 mm 内径 (I.D.)）色谱柱，使用 8 mL/分钟的流速；而对于较小直径的色谱柱（4 mm I.D.），使用 4 mL/分钟的流速。采用以下参数评估 SFC 色谱柱性能，如重现性、峰形、高效的 SFC 肽分离和保留因子。馏分收集后，纯化的肽样品使用旋转蒸发仪（步琦公司）旋干，随后在 4°C 下储存以备进一步分析。对上述三种肽的 SFC 纯化进行了三次重复测试 (n = 3)，并计算了标准偏差和相对标准偏差。
2.3. LC-MS 监测
本研究采用 LC-MS-2020（日本岛津公司）监测肽。该仪器包括一个二元泵、一个自动进样器、一个单四极杆质谱仪和一个 NM32LA 氮气发生器（英国Peak Scientific Instruments 公司）。LC-MS 分析中使用的两种流动相是流动相 A：Millipore 水（美国 Millipore 公司）和流动相 B：乙腈（德国默克公司）。这些流动相均含有浓度为0.1% (v/v) 的甲酸作为离子对试剂（德国默克公司）。使用10 μL进样体积，用于粗四肽 (1 mg/mL)、八肽 (2 mg/mL) 和九肽 (1.5 mg/mL)。四肽使用 LC-MS 方法 A 进行分析，采用 5%-95% 的梯度曲线，其中乙腈在 18 分钟内从 5% 升至 95%。八肽和九肽使用 LC-MS 方法 B 进行分析，其中乙腈梯度在 22 分钟内变为 5-70%。两种方法的流速均为1.0 mL/分钟，使用不锈钢 YMC-triart C₁₈ 色谱柱（日本 YMC 公司），其尺寸如下：粒径5 μm，内径 4.6 mm，长度 150 mm，孔径 120 Å。雾化器设定为 1.5 bar，去溶剂气温度设定为 250°C。MS 谱图在正离子模式下进行，质量范围从 200 到 1500 m/z。
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